RetroNectin逆轉錄技術操作流程

RetroNectin技術可以顯著提高逆轉錄病毒的轉染效率，這一發(fā)現(xiàn)克服了向造血干細胞中導入基因的困難?，F(xiàn)在，RetroNectin技術已成為使用逆轉錄病毒進行轉染操作的常規(guī)選擇，其操作流程大致如下：

1. 注射用水或滅菌蒸餾水充分溶解RetroNectin，調節(jié)濃度至1mg/ml。

2. 0.22 μm濾膜過濾RetroNectin溶液，分裝后-20 ℃保存。

3. 用緩沖液將RetroNectin溶液稀釋至20～100 μg/ml。

4. 將RetroNectin稀釋液加入24孔板，每孔0.5 ml (建議用PBS緩沖液稀釋RetroNectin后包被Non-Tissue Cluture Treated plate。

5. 室溫放置4小時或4 ℃，避光，過夜。

6. 吸出RetroNectin溶液，每孔加入PBS終止液0.5 ml。

7. 室溫放置30分鐘。

8. 加入適量PBS清洗孔板。

9. 吸出清洗液，得到RetroNectin包被的孔板 (如果暫不使用，可以在孔中加入適量PBS，用膠膜將平板蓋密封，避免RetroNectin干燥，可于4 ℃保存4周。使用前將PBS吸出) 。

10. 逆轉錄病毒保存液 (-80 ℃) 于37 ℃水浴融解。

11. 將病毒液加入包被后的24孔板，每孔300 μl。

12. 32 ℃放置4小時。

13. 吸出病毒保存液。

14. 每孔加入待轉染的細胞懸液400 μl (通常細胞濃度為1 × 105/ml) 。

RetroNectin刺激T細胞擴增方法

T-cell expansion protocol using RetroNectin reagent, GT-T551 T-cell medium, CultiLife bags, and anti-CD3 mAb.

1.  RetroNectin和CD3單克隆抗體包被培養(yǎng)袋。

2.  同時，來自PBMC的T細胞用GT-T551培養(yǎng)基+IL-2+血漿培養(yǎng)。

3.  第4天，T細胞轉移到培養(yǎng)袋，繼續(xù)用GT-T551培養(yǎng)基+IL-2+血漿培養(yǎng)。

4.  第7天，添加更多GT-T551培養(yǎng)基+IL-2。

5.  第10天，分裝兩個培養(yǎng)袋，添加更多GT-T551培養(yǎng)基+IL-2。

RetroNectin® 重組人纖維蛋白片段

RetroNectin^®是在大腸桿菌中產生的重組人纖維蛋白片段FN CH-296。 當包被在培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板表面時，RetroNectin^®能顯著增強逆轉錄病毒介導的基因轉移到哺乳動物細胞中。RetroNectin^®重組人纖維蛋白片段和CD3單抗共同作用可刺激T細胞的增殖和分化。

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